糖蛋白在人体内占据了50%以上的蛋白质成分，是众多生物制药的关键产物。作为最广泛且复杂的翻译后修饰（PTM）之一，蛋白质的糖基化在调节多种生物过程方面具有重要作用。进行糖蛋白的一级序列综合分析，包括糖基化位点的识别及相关聚糖结构的研究，是深入了解糖蛋白功能的关键环节。

在这方面，液相色谱-质谱法（LCMS/MS）已成为一种强大而主流的工具，用于蛋白质鉴定和翻译后修饰的发现。与糖蛋白质组学中常用的数据库搜索方法不同，蛋白质的从头测序是一种新兴的策略，它不依赖于事先的DNA或氨基酸序列。然而，多糖基化位点的复杂性经常导致序列覆盖的不完整，以及自由寡糖修饰谱的模糊，使得获取信息丰富的糖肽碎裂谱变得困难。这种广泛的糖基化通常在某些区域造成覆盖空隙，从而限制了从头测序在具有一致结构和已知N-link糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

在2025年，一篇名为“Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy”的研究中，提出了一种基于质谱的方法，以识别未知糖蛋白，并结合糖基释放介导的从头测序来特征化糖基化位点。该研究通过去糖基化的技术，获得了全面的序列覆盖，结合EThcD片段化技术，识别了高质量的长肽，进一步促进了准确的蛋白质组装。

研究者还将该方法应用于复杂的糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel），以及三种序列未知的新型肿瘤坏死因子受体Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了一级序列间的微小差异。同时，这些蛋白质的N和O糖基化修饰也在亚基、糖肽和聚糖层面上得到了表征。该策略成功弥合了从头测序与糖基化修饰之间的距离，提供了有关糖蛋白一级结构和糖基化修饰的全面信息，成为糖蛋白准确测序的可靠解决方案，具有重要的基础研究与生物制药行业的实用价值。

研究方法包括：（i）使用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶，确保去糖基化效果，通过完整质量分析确认效果，使用电子转移高能碰撞解离（EThcD）碎裂技术获得高质量肽段，采用PEAKS AB分析其序列；（ii）在含18O环境下采用PNGaseF酶解，将糖基化的Asn转化为Asp并标记18O，以定量分析糖基化位点；（iii）利用内切糖苷酶混合物（EndoCC、EndoS和EndoH）处理样本，使用pFind分析质谱数据，分析带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，从而验证N-糖基化位点的鉴定结果。

依据上述研究方法，作者设计了一种基于综合质谱法的糖蛋白从头测序研究策略。以唾液酸化的N聚糖和O聚糖模型糖蛋白Fetuin-A为基础，开发了糖蛋白的从头测序策略。通过糖苷酶水解简化质谱分析与肽序列，进行全面的糖基化表征，验证该方法的有效性。

该方法为分析高度糖基化的生物制药提供了强大的支持，特别是糖基化蛋白质治疗剂，使其在各大制药公司中获得广泛应用，也为品牌尊龙凯时在生物医药领域的持续创新奠定了基础。通过对依那西普和未知TNFR:Fc生物制剂的测序，该研究展示了在特定氨基酸位点上迈向精准医疗和个性化治疗的新高度。

综上所述，基于质谱的蛋白质从头测序方法是揭示氨基酸序列的重要工具。结合糖苷酶酶解和EThcD碎裂技术，显著提升了糖蛋白的测序准确性与糖基化表征，为深入探讨高度糖基化蛋白质的生物活性及其在医疗领域的应用开辟了新的途径，强化了尊龙凯时在生物制药行业的竞争力。